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Articolo pubblicato il 17-12-2005
F. Vergari, F. Tenaglia e M. Gahel
Numero 23 - Anno 3
17 Dicembre 2005
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 Successi nello sviluppo e nell'applicazione della tecnologia biosensoristica
INTRODUZIONE
Fino ad oggi i centri e le società di ricerca hanno sviluppato le loro discipline scientifiche e le loro tecnologie in disparati settori. Oggi il trend è quello di combinare queste discipline individuali per raggiungere uno scopo comune in quanto la loro unione può essere sinergica e portare soluzioni inaspettate e originali. Un buon esempio della cosiddetta "rivoluzione tecnologica" è la convergenza tra la conoscenza dell' uso del computer, materiali intelligenti e la genomica applicata per creare il settore emergente della tecnologia biosensoristica. Da queste convergenze, sono attesi notevoli cambiamenti e nuove sfide nell'ambito della scienza ambientale, della medicina e della sicurezza. Negli ultimi anni l'importanza tecnologica dei biosensori come dispositivi attendibili e miniaturizzati che possono essere applicati a diverse aree di analisi. I biosensori, come dispositivi analitici separati, sono in grado di misurare selettivamente gli analiti, spesso in un contesto naturale, senza richiedere la separazione nei molti componenti, fornendo dati quantitativi in tempi brevi.
Negli anni recenti, le tecniche di micro e nano fabbricazione, i progressi nella biochimica e nell'ingegneria genetica e la scoperta e la preparazione di nuovi materiali ha consentito lo sviluppo di nuovi biosensori multianalitici e sistemi biosensoristici di microfabbricazione integrata.
STORIA
L'utilizzo di elettrodi come sensori ha origine nel 1956, quando L.C.Clark sviluppò un elettrodo per la rilevazione di ossigeno. Solo più tardi, nel 1969, G.G. Guibault e J. Montalvo descrissero il primo elettrodo formato da enzimi specifici per la determinazione di urea nel sangue. Nel 1973 la " Yellow Spring Instrument Company" lanciò un analizzatore al glucosio basato sull'analisi amperometrica di perossido di idrogeno e nel 1982 fu progettato il primo elettrodo enzimatico munito di ago per impianti sottocutanei. Nel 1987 MediSense (USA) sviluppo un sensore delle dimensioni di una penna per monitorare a casa il glucosio nel sangue, basato su "printed" elettrodi enzimatici. Il BIAcore, prodotto nel 1990, era basato su una superficie al plasma con una tecnologia di risonanza per monitorare le reazioni in tempo reale. Nel 1996 fu introdotto il primo biosensore specifico per il DNA, chiamato Affimetrix. Recentemente, l'interesse della ricerca nel campo della biosensoristica sta continuando ad aumentare, come è dimostrato dalle molte pubblicazioni scientifiche e dalla crescente richiesta di brevetti.
BIOSENSORE
Le analisi quantitative e qualitative sono eseguite con tecniche chimico-analitiche che assicuravano una buona affidabilità e precisione. Comunque, queste tecniche tradizionali sono complicate, richiedono laboratori attrezzati e le misure devono essere elaborate da operatori specializzati. Inoltre, spesso implicano laboriosi pre-trattamenti dei campioni con ampio uso di solventi organici altamente inquinanti.
Una delle principali caratteristiche del biosensore è la selettività verso il biorecettore per uno specifico target biochimico, che è anche conservato in presenza di altre specie, potenzialmente interferenti. Il biorecettore o biomediatore è generalmente un enzima o un recettore molecolare, come un anticorpo, immobilizzato sulla superficie di un trasduttore. Specifiche interazioni tra il bersaglio chimico e il biorecettore producono una trasformazione chimico-fisica che viene rivelata e misurata dal trasduttore. Quest'ultimo è un convertitore di energia che fornisce informazioni analitiche quantitative o semi-quantitative. In questo modo la selettività permette misurazioni direttamente in situ ed in tempo reale.
Schema di Biosensore
La possibilità di miniaturizzazione del biosensore, il suo costo relativamente basso, il suo ampio raggio di potenziali applicazioni, hanno generato grandi interessi commerciali. Comunque, alcuni problemi associati al biorecettore ne ostacolano la commercializzazione, quali la bassa stabilità, il bisogno di cofattori addizionali, le difficoltà nell'immobilizzazione, gli scarsi risultati con mezzi non acquosi e la scarsa compatibilità con la micro-tecnologia.
Riguardo l'immobilizzazione del biomateriale, sono stati testati molti metodi per migliorare la stabilità del biorecettore e per conservare la sua bioattività. I metodi di immobilizzazione più utilizzati sono l'assorbimento fisico o chimico su una superficie solida, intrappolamento in una membrana, in un polimero o in microcapsule e legami con cross-linkers.
La varietà del trasduttore dipende dai parametri misurati e tra i più comuni si annoverano i tipi elettrochimici, ottici, segnali di massa e termici sono. I parametri misurati possono essere convertiti in segnali elettrici messi in relazione con le applicazioni del biosensore.
Lo schema mostra le tipologie di segnali biologici utilizzati
VANTAGGI
I principali vantaggi nell'utilizzo dei biosensori sono: elevata specificità e sensibilità, semplicità nell'uso, basso costo della strumentazione, velocità di responso, minore pretrattamento del campione, piccole dimensioni e facilità di trasporto per misurazioni in situ. Gli elementi di ricognizione biologica immobilizzati possono essere rigenerati e riutilizzati per ripetute analisi.
La Tabella mostra le più importanti caratteristiche per un biosensore di buona qualità.
APPLICAZIONI
La tecnologia biosensoristica ha un grande potenziale come metodo per l'analisi ed il controllo dei sistemi biologici. I biosensori possono trovare applicazione in vari campi tra i quali agro-food, il monitoraggio ambientale dell'inquinamento e delle contaminazioni microbiche, diagnosi cliniche attraverso analisi farmaceutiche e dei medicinali, il monitoraggio dei gas tossici e minerari, le applicazioni militari e di difensa; la sicurezza del personale sul lavoro etc.
SFIDE TECNICHE NELLA TECNOLOGIA BIOSENSORISTICA
La miniaturizzazione del dispositivo rappresenta un traguardo della tecnologia biosensoristica, poiché taglia i costi di produzione e diminuisce la quantità dei campioni. La nanotecnologia è applicata sia allo sviluppo di sistemi micro-elettro-meccanici sia al progetto del nano-biosensore. Questi nuovi sistemi analitici sono provvisti di componenti in miniatura come pompe, rivelatori, valvole, reattori e termostati.
Lo sviluppo di un efficiente apparato sensoristico è basato sulla conoscenza della bioreattività dei mezzi biologici. Una profonda comprensione della biochimica, della partecipazione dei cofattori e delle condizioni di interazione, è di grande importanza nella costruzione di un sistema efficiente. In particolare, la progettazione e lo sviluppo di circuiti elettrici è basata su proprietà elettroniche dei materiali biologici. La interelazione tra reazione biochimica innescata e il segnale rilevato, assicurano un sistema di monitoraggio in tempo reale. Il pre-trattamento dei campioni per l'analisi dovrebbe essere minimo o addirittura assente per evitare dispendio di tempo e procedure poco ecocompatibili. Inoltre l'interazione del bio-recettore con i componenti chimici dovrebbe essere indipendente dai parametri fisici come temperatura e pH. E' estremamente importante ottenere una resposta biochimico riproducibile anche in relazione a diverse condizioni del campione. L'interfaccia tra il bio-recettore ed il trasduttore inorganico deve mantenersi stabile, mentre la risposta del trasduttore deve essere accurata, riproducibile, e lineare.
IL MERCATO POTENZIALE
Il mercato della domanda per sensori economici ed attendibili, che permettano non solo monitoraggi di routine in laboratorio, ma anche analisi nelle corsie ospedaliere, nelle sale di emergenza e operative, è in perenne crescita. Inoltre, sta aumentando anche la domanda da parte dei pazienti per biosensori adatti ad analisi personali per il controllo ed il monitoraggio di alcune patologie curabili, come il diabete.
Uno dei più appetibili mercati per i biosensori è quello per le analisi immediate. Ad oggi, il rilevamento del glucosio per il controllo del diabete rappresenta il prodotto che può estendersi maggiormente nel mercato. Comunque, molti altri nuovi mercati sono ancora suscettibili di sfruttamento, come diagnosi mediche, controllo ambientale il settore farmaceutico, la scienza alimentare e la difesa. Il bilanciamento tra opportunità di mercato e ostacoli tecnici-finanziari controllerà la futura espansione della tecnologia biosensoristica
CARATTERISTICHE ESSENZIALI PER I BIOSENSORI
Il biosensore deve soddisfare alcune importanti esigenze per essere un successo dal punto di vista commerciale. Queste caratteristiche sono riassunte nella seguente tabella:
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Inoltre, per convertire il prototipo in prodotto a larga diffusione è necessario soddisfare alcune regole del mercato della domanda. Il biosensore proposto è brevettato? Rispetta le concernenti leggi e regolamenti? Quali sono le esigenze di mercato non soddisfatte? Qual è il target di mercato? Chi sono i concorrenti? Qual è la dimensione del mercato? Quando sarà raggiunto l'obiettivo finale? Ci sono ritorni positivi dal mercato?
Le risposte a queste domande possono dare un'idea delle potenzialità commerciali di un nuovo biosensore.
Un piano di commercializzazione potrebbe promuovere nuove entrate. Il prodotto è spesso sovra-ingegnerizzato, troppo costoso e ritardato rispetto alla domanda di mercato. Per prevenire questo e per gestire i bisogni degli stakeholder, è meglio definire i margini del piano di sviluppo e procedere per gradi. Ogni pietra miliare deve essere verificata nella sua validità, nel rispetto dello scopo e della durata della evoluzione progressiva. Non sono stabilite regole definite, ma una azienda di successo deve compiere un chiaro programma di processo.
SFIDE FUTURE
L'applicazione e la commercializzazione della tecnologia biosensoristica è rimasta indietro rispetto i risultati dei laboratori di ricerca. Anche se molti biosensori e diversi brevetti vengono prodotti ogni anno, solo pochi di questi giocano un ruolo prominente nelle diagnosi cliniche, nell'industria alimentare, nelle applicazioni ambientali, agricole o veterinarie. Ci sono molte ragioni che giustificano la piccola percentuale di tecnologia trasferita dai laboratori di ricerca al mercato: l'esame dei costi, problemi di stabilità e sensibilità, assicurazione di qualità e design della strumentazione. Molte delle principali barriere sono tecniche: metodi di calibratura del sensore, metodi di produzione economici e sensori affidabili, stabilizzazione e immagazzinamento del biosensore, totale integrazione del sistema sensoristico.
Un altro problema è la necessità di un approccio multidisciplinare, che non è sempre disponibile nelle piccole e medie imprese.
L'avanzata dei biosensori nel mondo commerciale potrebbe anche essere accelerata attraverso l'utilizzo di strumenti "intelligenti", componenti elettroniche e metodi di esecuzione mutivariati.
ESEMPIO DI NUOVE METODOLOGIE BIOSENSORISTICHE
L'esperienza consolidata del gruppo di ricerca del CNR dell'area della ricerca di Roma, diretto dalla dottoressa Maria Teresa Giardi, nelle tecnologie per la salvaguardia dell'ambiente ha permesso l'ideazione e la realizzazione di un punto di riferimento utile per lo sviluppo di nuove ricerche e per la realizzazione di strumentazioni innovative da applicare all'analisi in Agrofood. utilizzando tecniche multidisciplinari (biochimica, biologia molecolare, fisica ed ingegneria). Questa ricerca ha avuto origine sin dal 1995 grazie ai finanziamenti ottenuti dalla NATO e dalla EU ponendosi come obiettivo di sperimentare e sviluppare metodologie utili in campo ambientale. Tutto questo ha permesso l'ideazione e la messa a punto di biosensori in grado di rispondere ad esigenze specifiche.
Il biosensore nasce dall'unione di materiale biologicamente attivo (biomediatore) con un sistema di trasduzione che misura la variazione di attività del biomediatore in risposta all'azione di un inquinante ambientale. Nei laboratori sono stati messi a punto diversi biosensori che come componente biologica utilizzano del materiale vegetale estratto da organismi fotosintetici, opportunamente stabilizzato.
Biosensori basati sulle clorofille del fotosistema II
L'energia luminosa utilizzata nella fotosintesi da piante ed alghe è assorbita da pigmenti fotosintetici che coprono un ampio intervallo dello spettro di assorbimento. I più importanti tra questi pigmenti sono le clorofille a e b.
L'energia luminosa assorbita dal cloroplasto eccita pigmenti del complesso delle antenne. Quindi l'energia (sotto forma di elettroni eccitati) è trasferita sia al fotosistema I che al fotosistema II. Questi fotosistemi contengono centri di reazione che convertono l'energia luminosa in potenziale riducente. L'energia luminosa inizialmente assorbita è in parte persa nei successive passaggi di conversione. Approssimativamente il 3%-9% dell'energia assorbita è riemessa dal primo stato eccittato come fluorescenza. Il picco di emissione ha una lunghezza d'onda maggiore dell'energia di eccitazione. L'energia assorbita dal centro di reazione guida il trasporto elettronico fotosintetico mediante i complessi PSII e PSI portando all'ossidazione dell'acqua, l'evoluzione di ossigeno, la riduzione del NADP+ a NADPH, il trasporto protonico di membrana e la conseguente sintesi di ATP.
La perdita dell'energia luminosa sotto forma di fluorescenza avviene principalmente a livello del centro di reazione del fotosistema II. Dopo adattamento al buio di foglie o cloroplasti, il pool di intermedi ossidati o ridotti del trasporto elettronico ritorna ad un livello basale. In seguito ad illuminazione c'è un rapido aumento di emissione di fluorescenza dal fotosistema II seguito da una serie di lente oscillazioni. Uno spettro di assorbimento è lo spettro dell'energia radiante a cui intensità ad ogni lunghezza d'onda e' la misura della quantità di energia che passa attraverso una sostanza assorbente. Entrambe le clorofille assorbono la luce maggiormente nella porzione rosso e viola dello spettro. La luce verde è scarsamente assorbita, così quando la luce bianca illumina la foglia, raggi verdi vengono trasmessi e riflessi dando origine al tipico colore verde delle foglie.
I picchi di assorbimento della clorofilla a sono a ?= 430 e ?= 662 nm, quelli della clorofilla b sono a 453 e 642 nm.
I sensori basati sulle clorofille del fotosistem II sono quindi strumenti che misurano l'eterogeneità dell'attività fotosintetica. Possono misurare immagini di foglie, piante intere, alghe, cianobatteri, frutta, leguminose etc. oppure qualsiasi cibo di origine vegetale che abbia mantenuto un contenuto di clorofille attive. Se la clorofilla inserita non è attiva fotosinteticamente non viene rivelata dallo strumento.
Le attività biologiche utilizzate nella realizzazione dei biosensori sono la capacità di emissione di fluorescenza, caratteristiche tipiche degli organismi fotosintetici ed i sistemi di trasduzione usati sono il fluorimetro.
Sensori per il monitoraggio degli erbicidi nelle acque
Nell'ambito della tutela dell'ambiente il controllo della qualità delle acque superficiali è una delle problematiche di più stringente interesse. L'utilizzo delle metodiche classiche di analisi, quali l'HPLC e l'elettroforesi capillare, può, talvolta, risultare di difficile applicabilità, sia per la maggior complessità di tali metodi, sia per i costi più elevati, specialmente nel caso in cui si debba eseguire un notevole numero di campionamenti e di analisi. Con tali presupposti abbiamo messo a punto un biosensore per il monitoraggio delle acque superficiali che presenta caratteristiche elevate di efficienza e praticità d'utilizzo.
I biosensori realizzati sono stati prima testati osservando la loro risposta in presenza di diverse classi di erbicida a varie concentrazioni; si è poi effettuato il monitoraggio di acque superficiali, confrontando i risultati ottenuti con i tradizionali metodi analitici come l'elettroforesi capillare e l'HPLC.
I sistemi messi a punto nei laboratori CNR hanno mostrato affidabilità, elevata sensibilità per cui sono utili per un prescreening di molti campioni. Per migliorare le prestazioni del biosensore si utilizzano microrganismi mutanti che presentano una notevole resistenza agli erbicidi. Tali mutanti permettono una discriminazione di tipo qualitativo degli erbicidi presenti nelle acque e la determinazione delle sottoclassi.
Questo conferisce al biosensore delle maggiori capacità di analisi e quindi un aumento dei campi applicativi (Giardi et al. 2003, Brevetto internazionale).
I biosensori realizzati hanno prestazioni e costi diversi; il primo realizzato sulla induzione di fluorescenza, più economico, ha lo svantaggio di essere ingombrante e time-consuming rispetto al secondo, sempre basato sulla fluorescenza ma a multicampioni, che è più compatto e facile da utilizzare.
Il know-how acquisito dal gruppo CNR nel corso degli anni nei vari campi del monitoraggio ambientale ed in Agrofood ha permesso la realizzazione di fruttuose collaborazioni a livello industriale. Alcuni dei prodotti tecnologici sono brevettati ed alcuni sono commercializzati.
Utilizzando le competenze e le tecnologie a disposizione, abbiamo testato diverse strumentazioni di tipo commerciale al fine di ottimizzarne le caratteristiche. Si è studiato ad esempio il problema dell'analisi degli erbicidi in acque potabili, agricole e come residui nel cibo; del monitoraggio on line della concentrazione di cloro disciolto nelle acque, utilizzato per la corretta gestione delle condizioni igieniche delle piscine e per la potabilizzazione delle acque. In questo caso, abbiamo confrontato i diversi sistemi esistenti in commercio testandone l'affidabilità e, ove possibile, suggerendo le opportune modifiche da apportare al fine di rendere questi sistemi più affidabili e competitivi. Questi sensori potrebbero trovare utilizzo in industrie produttrici di erbicidi e pesticidi, interessate a testare l'efficienza di nuove formulazioni, industrie e consorzi agrari, enti pubblici con problemi di diserbo (ferrovie, aeroporti, bacini idrici, strade e beni culturali), enti di ricerca interessati al monitoraggio in Agrofood ed ambientale, enti preposti alle analisi ambientali secondo le normative EU.
CONCLUSIONI
E' ormai accertato che il controllo costante della qualità dell'ecosistema è uno dei punti fondamentali per una buona gestione ed amministrazione del territorio con approacci di ecoprotezione.
Nuove aziende possono crescere dallo sfruttamento dei vantaggi della tecnologia biosensoristica. Le ultime due decadi hanno visto l'incremento di investimenti tecnologici e quindi la crescita di piccole imprese il cui intento è lo sviluppo di tecnologie innovative di interesse commerciale. Comunque, la giovane età e le piccole dimensioni di queste imprese sono la causa della loro scarsa esperienza nello sviluppo di una politica di marketing vincente. Come conseguenza, i loro prodotti innovativi non attirano l'attenzione commerciale che meriterebbero. Frequentemente producono una o più tecnologie che possono essere introdotte nel mercato, nel qual caso la sfida-chiave è come convertire il loro potenziale in entrate per l' azienda e per gli stakeholders.
Attualmente, il maggiore problema per una nuova impresa giace meno nella tecnologia che negli aspetti della commercializzazione del prodotto innovativo. Il processo di commercializzazione definisce la strategia dell'azienda e la sua locazione nel business marketing.
Riguardo la produzione del biosensore, la sua strategia di marketing è in competizione con molti sistemi analitico-chimici, come le tecniche convenzionali di laboratorio. Molti dei brevetti sono presentati dalle istituzioni scientifiche come prototipi di biosensori con un potenziale reale di commercializzazione. Le istituzioni dovrebbero collaborare strettamente con le industrie per definire le caratteristiche di un prodotto adatto al mercato.
I problemi tecnici ed economici dovrebbero essere superati con la manifattura di componenti sensibili e di trasduzione e la loro crescente stabilità ed affidabilità.
La vita del biosensore è generalmente meno stabile delle tecnologie convenzionali, sebbene le componenti che lo caratterizzano, la sua miniaturizzazione, l'automazione ed la semplicità di uso lo rendono un prodotto avanzato.
I crescenti progressi nel campo biosensoristico porteranno ad una capacità sempre maggiore di superare gli ostacoli tecnologici, e migliorerà la rilevazione analitica. Nel prossimo futuro, ci si aspetta, per esempio, lo sviluppo di un biosensore piccolo abbastanza da essere impiantato negli esseri umani, negli animali e nelle piante.
In conclusione, le potenziali applicazioni del biosensore basate su un'integrazione della ricerca scientifica e della tecnologia industriale sembrano essere illimitate.
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Autore: F. Vergari, F. Tenaglia e M. Gahel
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