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Articolo pubblicato il 30-07-2005
di Alberto Revelli, Federica Moffa e Marco Massobrio
Numero 18/19 - Anno 2
30 Luglio 2005
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 Preservazione della fertilità mediante crioconservazione del tessuto ovarico ed autotrapianto: qualcosa in più di un sogno
Introduzione
I primi esperimenti di crioconservazione di tessuto ovarico furono effettuati negli anni 1950-60, quando frammenti di ovaio murino furono congelati a -79°C in una soluzione contenente glicerolo (1, 2, 3).
La prima gravidanza da tessuto ovarico crioconservato e scongelato fu ottenuta nel topo già nel 1960 (4), ma soltanto negli ultimi quindici anni sono stati messi a punto protocolli di congelamento e scongelamento innovativi che hanno consentito di ottenere risultati incoraggianti nel modello animale e di aprire la sperimentazione al modello umano.
Oggi la crioconservazione del tessuto ovarico rappresenta una delle strategie più ambiziose nel tentativo di preservare la fertilità in donne con patologie (prevalentemente oncologiche) in grado di compromettere la riserva follicolare ovarica e le possibilita' riproduttive.
La crioconservazione di frammenti ovarici e' applicabile anche nel caso di pazienti in età pediatrica, non presuppone alcuna stimolazione ormonale dell'ovaio e da una biopsia ovarica è possibile ottenere centinaia di follicoli primordiali contenenti ovociti immaturi, che risultano molto resistenti ai processi di congelamento e scongelamento (5).
Indicazioni alla crioconservazione di frammenti ovarici umani
Le situazioni nelle quali puo' trovare applicazione la crioconservazione di frammenti ovarici allo scopo di preservare la fertilita' sono le seguenti:
- Pazienti affette da neoplasie: le nuove strategie antitumorali hanno portato negli ultimi anni ad un progressivo aumento della sopravvivenza media delle bambine e delle giovani donne affette da neoplasie quali linfomi, leucemie, tumori della mammella e sarcomi, ponendo l'attenzione sugli effetti a lungo termine delle terapie oncosoppressive e sulla qualità di vita delle pazienti dopo il trattamento. E' stato stimato che all'inizio del 21 secolo, un adulto su 1000 nella terza decade di vita, sarà sopravvissuto ad un tumore in età pediatrica (44).
In tessuti a rapida proliferazione cellulare, quali il midollo osseo o l'intestino, il danno citotossico della chemioterapia e della radioterapia è pressoche' totalmente reversibile, mentre a livello ovarico, dove il numero di cellule germinali è limitato e predeterminato alla nascita, esso è progressivo ed irreversibile. I trattamenti chemio e radioterapici sono in grado di causare in una percentuale rilevante delle pazienti oligo/amenorrea transitoria o persistente e, nel lungo periodo, menopausa precoce; tali terapie, inoltre, sono in grado di danneggiare in maniera imprevedibile il patrimonio genetico degli ovociti. L'entità del danno al potenziale riproduttivo è variabile e dipende dall'età della paziente, dal tipo di trattamento scelto dagli oncologi e dalla dimensione iniziale della riserva follicolare ovarica (6-15).
Sul piano psicologico la prospettiva della perdita del potenziale riproduttivo aumenta lo stress cui sono sottoposte le pazienti, preoccupate dal rischio di un peggioramento della qualità di vita anche a lungo termine. L'illustrazione dei problemi relativi alla perdita della fertilità e alla loro possibile soluzione al momento della comunicazione della diagnosi oncologica offre qualche speranza in piu' in un futuro in cui, guarite dal cancro, la vita deve tornare ad essere il piu' possibile normale (16).
- Rischio di ovariectomia bilaterale effettuata come trattamento di cisti ovariche benigne, per esempio nell'endometriosi recidivante o nel caso di teratomi benigni bilaterali.
- Storia familiare di esaurimento ovarico precoce in pazienti la cui madre e' andata in menopausa prima dei 42 anni e che corrono un rischio aumentato di esaurimento precoce della funzione ovarica, che puo' sopravvenire anche in giovanissima eta' (prima dei 30 anni).
Crioconservazione del tessuto ovarico
Le ricerche nel campo della crioconservazione del tessuto ovarico hanno conosciuto un certo impulso solo in tempi relativamente recenti, quando Gosden ha ripreso gli studi in questo ambito, adottando tecniche di congelamento più moderne (17, 18).
Nel topo, nel ratto e nella pecora sono stati applicati protocolli di congelamento lento/scongelamento rapido sia su frammenti ovarici, sia sull'ovaio in toto, utilizzando come crioprotettori il dimetilsulfossido (DMSO) o l'1,2-propandiolo (PROH). Con queste tecniche la percentuale di sopravvivenza dei follicoli primordiali allo scongelamento, in passato molto bassa, si e' assestata attorno al 70-80% ed è stato possibile ripristinare e mantenere per svariati mesi la funzionalità ovarica negli animali dopo ritrapianto autologo dei frammenti scongelati. Le analisi istologiche condotte sui frammenti ritrapiantati hanno evidenziato una buona percentuale di sopravvivenza follicolare anche a distanza di diverse settimane, nonostante evidenti danni da ischemia legati all'impossibilita' di effettuare reanastomosi vascolari (19, 20, 21). Sono state ottenute gravidanze spontanee dopo ritrapianto di frammenti ovarici crioconservati sia nel ratto (22), sia nella pecora (23, 24) e recentemente anche nella donna (45).
Nel 1996 Hovatta et al. (25) hanno effettuato il primo esperimento di congelamento di tessuto ovarico umano, dimostrando che l'ovaio umano è resistente ai procedimenti di crioconservazione. Studi successivi hanno confermato che nel tessuto ovarico umano i follicoli primordiali sono i più resistenti e sono in grado di sopportare i danni provocati dai processi di congelamento/scongelamento, legati soprattutto all'ischemia delle prime ore post-trapianto, precedente la rivascolarizzazione spontanea del tessuto (26, 27). Recentemente sono state dimostrate sia la presenza di follicoli primordiali vitali nel tessuto ovarico umano ritrapiantato in topi immunodeficienti (SCID mice), sia addirittura la possibilità di indurre con FSH esogeno l'ovulazione dello xenotrapianto (28-30).
Tecniche di prelievo del frammento ovarico
Il tessuto ovarico destinato alla crioconservazione viene di norma prelevato nel corso di un intervento laparoscopico, a meno che la paziente non debba essere sottoposta a laparotomia per altra indicazione.
L'intervento in laparoscopia presenta notevoli vantaggi:
- la possibilità di essere effettuato con minimo preavviso evitando così di dover posticipare qualsiasi tipo di terapia oncologica;
- la bassissima percentuale di complicazioni intra- e post-operatorie;
- la breve durata dell'intervento (15-20 minuti);
- l'assenza di esiti aderenziali a distanza in sede di prelievo.
Considerando che in una donna di circa 30 anni si contano approssimativamente 35 follicoli primordiali per millimetro quadrato di corticale ovarica, sono sufficienti cinque frammenti cubici di corticale di 5 mm di lato per ottenere più di 4.000 follicoli primordiali.
I frammenti possono essere prelevati incidendo superficialmente la corticale ovarica mediante forbici da laparoscopia o utilizzando uno specifico strumento metallico studiato per ottenere frammenti di 5 mm di diametro e 2-3 mm di spessore (31).
Nel caso si debba effettuare l'ovariectomia per la presenza di una patologia che richiede tale procedura, e' spesso possibile ritrovare e crioconservare frammenti di parenchima ovarico sano ai margini del pezzo operatorio.
Il prelievo di frammenti bioptici di corticale ovarica e' applicabile anche nel caso di pazienti pediatriche ed anche contestualmente ad altre procedure chirurgiche (es, l'espianto del midollo osseo) e rappresenta un approccio giustificato anche in pazienti in cui vi sia una probabilità di recupero spontaneo della funzionalità ovarica post-radio/chemioterapia. In questo caso si tratta di offrire a queste pazienti una sorta di "doppia possibilita'" per conservare parte del potenziale riproduttivo.
Interventi piu' radicali, come l'ovariectomia monolaterale, possono essere presi in considerazione in pazienti che si sottoporranno a trattamenti ad effetto sterilizzante (es. la radioterapia "total body") allo scopo di permettere la crioconservazione della corteccia ovarica in toto.
Se la paziente sara' curata con radioterapia pelvica esclusiva e non con chemioterapia (es. per un cancro della cervice uterina), e' anche possibile autotrapiantare temporaneamente l'ovaio in toto in altra sede (es. una tasca tra i muscoli dell'avambraccio) eseguendo una microanastomosi vascolare. Terminate le cure radioterapiche, l'ovaio potra' essere riportato nella sua sede d'origine anastomizzando il peduncolo vascolare ai vasi infundibolo-pelvici.
Tecnica di congelamento e scongelamento del tessuto ovarico umano
La maggior parte dei protocolli attualmente in uso prevede il congelamento lento associato allo scongelamento rapido. I frammenti ovarici, posti nel terreno di congelamento all'interno di criotubi, vengono raffreddati gradualmente mediante un congelatore programmabile e successivamente immersi in azoto liquido, ove possono essere conservati per un tempo indeterminato (26).
Sono allo studio, inoltre, tecniche di congelamento ultra-rapido in presenza di elevate concentrazioni di crioprotettori (vitrificazione), già applicate con successo nella crioconservazione del tessuto ovarico umano fetale (32).
La percentuale di sopravvivenza allo scongelamento dei follicoli primordiali varia nell'ovaio umano in base al crioprotettore utilizzato: è dell'84% nel caso dell' Ethilen-Glicole (EG), del 74% e 44% rispettivamente per il Dimetilsulfossido (DMSO) e il Propandiolo (PROH), mentre si riduce al 10% quando venga utilizzato il Glicerolo (GLY) (26). Altri crioprotettori non permeanti quali il saccarosio o il mannitolo sono di norma aggiunti al terreno di congelamento in associazione con sostanze proteiche derivate dal siero oppure sintetiche, che svolgono un ruolo protettivo nei confronti della membrana plasmatica dell'ovocita nella fase di scongelamento.
Autotrapianto del tessuto ovarico dopo lo scongelamento
Il problema più complesso con cui fare i conti e' rappresentato dalla sopravvivenza allo scongelamento dei soli follicoli primordiali, i quali contengono ovociti immaturi, diploidi e completamente inadatti alla fertilizzazione. La maturazione di questi follicoli e degli ovociti in essi contenuti e' il requisito fondamentale per ottenere la gravidanza.
Le strade percorribili per raggiungere questo scopo sono diverse, ma la piu' promettente allo stato attuale sembra essere quella dell'autotrapianto. Si tratta del posizionamento dei frammenti ovarici crioconservati nella sede originaria (fossetta ovarica) mediante autotrapianto per via laparoscopica. Oktay e colleghi hanno dimostrato la possibilita' di attecchimento dei frammenti così trapiantati e la possibilità di indurre l'ovulazione con gonadotropine a distanza di 15 settimane e a sei mesi dall'autotrapianto (33, 34). Questa tecnica, finalizzata a ripristinare l'ovulazione nella sede naturale dell'ovaio, offre teoricamente la possibilità di ottenere un concepimento spontaneo senza il ricorso a tecniche di fecondazione in vitro. Poiché, tuttavia, la fossetta ovarica non è altamente vascolarizzata, essa non costituisce una sede ottimale per il trapianto.
Recentemente, il gruppo belga di Donnez ha ottenuto la prima gravidanza in una giovane donna sottoposta a crioconservazione di tessuto ovarico e ritrapianto dopo scongelamento. I frammenti ovarici, crioconservati prima che la paziente fosse sottoposta a chemioterapia per linfoma di Hodgkin stadio IV, sono stati ritrapiantati sul moncone di ovaio residuo, conservato ai tempi dell'intervento. Dopo 5 mesi dall'impianto, l'attecchimento dei frammenti così trapiantati ha permesso la ripresa della funzionalità ovarica e 11 mesi dopo il trapianto la paziente ha concepito spontaneamente (45). Sebbene via sia la documentazione del fatto che l'ovulo fecondato sia originato dalla porzione di ovaio su cui era stato effettuato l'autotrapianto, esistono alcune perplessita' dovute al fatto che in teoria si sarebbe potuta verificare un'ovulazione anche dal frammento ovarico lasciato in sede ai tempi del primo intervento. Resta il fatto che quello descritto da Donnez e' verosimilmente il primo caso di una gravidanza insorta spontaneamente dopo crioconservazione di frammenti ovarici e loro ritrapianto in sede pelvica ortotopica.
Meirow e colleghi hanno inoltre descritto, nel 2005, la prima gravidanza a termine dopo fertilizzazione in vitro in una paziente di 28 anni affetta da linfoma non-Hodgkin, la quale era stata sottoposta a crioconservazione del tessuto ovarico prima della somministrazione di chemioterapia ad alte dosi (46). La paziente, in amenorrea da 24 mesi dopo i trattamenti chemioterapici, è stata sottoposta a reimpianto ortotopico sull'ovaio residuo e 8 mesi dopo ha avuto una ripresa della funzionalità ovarica e della ciclicità mestruale. Dopo stimolazione ovarica, prelievo ovocitario e fertilizzazione in vitro, il trasferimento in utero di un embrione ha dato origine alla gravidanza, conclusasi con la nascita di una neonata sana. Nel caso descritto la possibilità che l'ovocita ottenuto derivasse dall'ovaio nativo è bassissima, date le alte dosi del trattamento chemioterapico subito dalla paziente e data la documentata amenorrea con elevati livelli di gonadotropine al momento del reimpianto.
I tentativi di trapianto eterotopico, in una sede diversa da quella naturale (ad esempio nell'avambraccio sotto il muscolo brachio-radiale) (37, 38), hanno dato risultati incoraggianti, con ripresa della funzione endocrina del tessuto ovarico e della ciclicità mestruale, ma i tentativi di fertilizzazione in vitro degli ovociti ottenuti da questa sede non hanno mai dato origine a gravidanze.
E' importante, in caso di autotrapianto sia ortotopico che eterotopico, considerare che nelle pazienti oncologiche esiste il rischio di ritrapiantare cellule neoplastiche eventualmente contenute nella biopsia ovarica al momento dell'espianto; nonostante la crescente sensibilità delle tecniche di biologia molecolare disponibili per l'identificazione di eventuali cellule tumorali residue (es. Polymerase Chain Reaction o ibridizzazione in situ), nel caso di alcune neoplasie (es. le leucemie) la presenza di cellule tumorali nel frammento ovarico non puo' essere esclusa (35).
Al fine di minimizzare il rischio di ritrapiantare cellule neoplastiche, sono state studiate strategie alternative per l'utilizzo delle biopsie ovariche crioconservate. Le tecniche riportate di seguito sono da considerarsi altamente sperimentali ed alcune rimangono attualmente solo teoriche:
- Xenotrapianto. E' il trapianto dei frammenti ovarici umani crioconservati in animali di altre specie privati di "rigetto" immunologico (ad esempio gli SCID mice) (28-30). Sara' naturalmente necessario anche in questo caso il ricorso alla fecondazione in vitro degli ovociti ottenuti.
- Crescita follicolare ed ovulazione in vitro (IVM). I frammenti ovarici o i singoli follicoli primordiali ottenuti per dissezione meccanica dai frammenti ovarici scongelati possono teoricamente essere coltivati in vitro fino all'ottenimento di ovociti maturi e fecondabili in vitro (39, 40, 41).
- Tecniche di nuclear transfer. L'ultima frontiera e' costituita dalle tecniche di nuclear transfer, ossia di trasferimento del nucleo di un ovocita immaturo contenuto in un follicolo primordiale scongelato nel citoplasma di un ovocita fresco di donatrice (42, 43). Questa tecnica avveniristica offrirebbe la possibilità di bypassare la maturazione in vitro.
Conclusioni
La preservazione della fertilita' delle bambine e delle giovani donne, soprattutto quelle che si devono sottoporre a trattamenti oncostatici, e' un'esigenza fondamentale per le pazienti nell'ambito di un sistema sanitario evoluto che si faccia carico anche della qualita' della vita futura delle pazienti.
Le terapie antitumorali in molti casi non impediscono la riproduzione, ma in queste donne si osserva frequentemente una diminuzione della fertilita' ed una tendenza spiccata alla menopausa precoce. Vi sono inoltre preoccupazioni irrisolte circa la salute a lungo termine dei bambini concepiti da donne i cui ovociti hanno subito l'insulto della chemio/radioterapia antitumorale. Solo un numero molto maggiore di nati da queste pazienti consentira' di stabilire l'entita' del danno genetico subito dagli ovociti nel corso di tali terapie.
Le tecniche attuali consentono di crioconservare per lunghissimo tempo frammenti di ovaio umano con buoni risultati in termini di sopravvivenza follicolare dopo lo scongelamento. I numerosi studi attualmente in corso in questo campo miglioreranno ulteriormente la "survival rate" degli ovociti e dei follicoli crioconservati.
I problemi che attualmente non hanno trovato una risposta definitiva sono: quale sia la migliore strategia per impiegare i frammenti ovarici dopo lo scongelamento e come ottenere da essi delle gravidanze senza rischiare di reintrodurre nella paziente anche la malattia tumorale dalla quale e' faticosamente guarita.
Le gravidanze recentemente ottenute dopo ritrapianto del tessuto crioconservato, ancorchè casi isolati, dimostrano la fattibilità di preservare la fertilità femminile con questa metodica e accendono la speranza per centinaia di migliaia di pazienti. Attualmente però non esistono dati conclusivi sull'efficienza e sulla sicurezza assoluta della procedura, che possono infatti variare da caso a caso in modo ancora non prevedibile.
Una frase puo' riassumere lo stato dell'arte in questo campo di ricerca: "Now it's time to freeze, time to thaw is coming".
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Autore: Alberto Revelli, Federica Moffa e Marco Massobrio
Centro di Medicina della Riproduzione, Dipartimento di Discipline Ginecologiche ed Ostetriche, Università degli Studi di Torino, Azienda Ospedaliera OIRM-S. Anna, Torino
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