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Articolo pubblicato il 17-11-2006
di Fumagalli Marta, Verderio Claudia e Abbracchio Maria Pia
CNR Institute of Neuroscience
Milano
Numero 33-34 - Anno 3
17 Novembre 2006
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Scoperto un nuovo recettore che media la propagazione del danno cerebrale da ictus
Abstract
An italian team, directed by University of Milan professor Maria Abbracchio,
has identified a new receptor (GPR17), that plays a key role in the progression of
brain ischemic damage. GPR17 was previously known as an “orphan” G-protein-coupled receptor,
i.e., nothing was known regarding its physiological ligand and pathophysiological roles.
The Italian team has cloned and expressed GPR17 in mammalian cells and determined its
response profile in vitro.
Unexpectidely, GPR17 was shown to specifically respond to
two unrelated families of endogenous ligands: "uracil nucleotides" and
"cysteinyl-leukotrienes", proinflammatory mediators known to be released in
tissues after induction of ischemia and trauma. This “dual” response is ”per se”
quite unusual, since all known G-protein-coupled receptors are activated by one single
family of endogenous ligands.
Interestingly, GPR17 was found to be highly expressed in
organs typically undergoing ischemic damage, that is, brain; heart and kidney; moreover,
in a rat focal brain ischemia model, GPR17 expression was markedly increased both within
and at the borders of brain ischemic areas, suggesting a role in propagation of ischemic
damage.
In the same animal model, the in vivo inhibition of GPR17 during ischemia by either
pharmacological agents or a specific biotechnological drug designed “ad hoc” to knock-down
GPR17 dramatically reduced ischemic damage. These data suggest GPR17 as the common molecular
target mediating brain damage by uracil nucleotides and CysLTs. Blockade of GPR17 thus
results in protection against ischemic damage propagation.
Based on the dual nature of GPR17,
these findings may lead to anti-ischemic "dual" drug of previously unexplored therapeutic
potential.
Un team tutto italiano di ricercatori, coordinato dalla prof.ssa Maria
Pia Abbracchio all’Università degli Studi di Milano, ha identificato un nuovo
recettore a G-proteina, GPR17, che ha un ruolo chiave nella propagazione del danno
cerebrale da ictus, malattia attualmente incurabile.
I ricercatori hanno clonato GPR17,
ed esprimendolo in sistemi eterologhi, ne hanno determinato il profilo di risposta
farmacologica con saggi funzionali, mostrando che, a differenza dei recettori a
G-proteina noti, GPR17 è un recettore "duale", ovvero in grado di rispondere
contemporaneamente a due distinte famiglie di mediatori infiammatori liberati in
gran quantità nei tessuti in conseguenza di insulto ischemico o traumatico: i
"nucleotidi uridinici" e i "cisteinil-leucotrieni”.
Non a caso, GPR17 é risultato
presente ad alti livelli negli organi che tipicamente vanno incontro ad ischemia,
come cervello, cuore e rene. In particolare, in un modello di ischemia cerebrale nel ratto,
GPR17 é presente in maggior quantità all'interno e ai bordi dell'area ischemica, suggerendo
un ruolo di tale recettore nella propagazione del danno da ischemia.
Negli animali sottoposti ad ictus cerebrale, l’inibizione di GPR17 con agenti farmacologici
o con un un farmaco biotecnologico specifico disegnato su misura per spegnere la proteina
recettoriale, e’ in grado di proteggere completamente gli animali dal danno ischemico,
suggerendo che GPR17 sia il bersaglio comune attraverso il quale nucleotidi uridinici
e cisteinil-leucotrieni inducono morte delle cellule cerebrali dopo ictus.
Questa scoperta apre la strada allo sviluppo di farmaci "duali" contro l'ischemia
cerebrale, che, proprio perché duali, saranno dotati di potenza terapeutica inesplorata.
Introduzione: l'ischemia cerebrale
Il danno cerebrale conseguente a ictus è controllato da un nuovo recettore, GPR17,
la cui peculiare natura “duale” lo rende in grado di rispondere a due diverse famiglie
di trasmettitori pro-infiammatori non imparentate fra di loro e liberate in gran quantità
nel cervello ischemico: i “nucleotidi uridinici” e i “cisteinil-leucotrieni".
Questa é l'importante scoperta a cui è giunto il gruppo coordinato dalla Prof.ssa Maria
Pia Abbracchio del Dipartimento di Scienze Farmacologiche dell’Università degli Studi
di Milano in collaborazione con un "team" tutto italiano di ricercatori delle Università
di Pisa e Urbino, del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) di Milano, e del Centro
Cardiologico Monzino -Istituto di Ricovero e Cura a carattere scientifico.
Questa ricerca, del tutto indipendente, frutto di un lavoro durato cinque anni condotto
con finanziamenti pubblici italiani, e pubblicata sulla prestigiosa rivista "The EMBO Journal"
(gruppo "Nature"), apre la strada ad interventi terapeutici realmente innovativi per
una malattia che fino ad oggi é ancora in cerca di terapie realmente efficaci.
L'ictus cerebrale (anche noto come “ischemia cerebrale” o “stroke”) rappresenta la
principale causa di invalidità negli adulti e la terza causa di morte nei paesi
industrializzati. In Italia l'ictus colpisce poco meno di 200.000 persone all'anno,
circa una ogni tre minuti, prevalentemente (ma non solo) individui di mezza età ed anziani,
e ha un costo sociale ed economico notevole in quanto i pazienti, a causa del deficit
neurologico conseguente, sono costretti a uscire dal mondo produttivo, ad abbandonare
il proprio lavoro e a dipendere in modo sostanziale dal servizio sanitario nazionale
per quanto riguarda la disabilita’.
L’ictus si verifica per rottura od ostruzione di un vaso che porta l'ossigeno in una regione
del cervello; nella zona colpita dall’ ”infarto” cerebrale ("core ischemico"), non piu'
irrorata dal sangue, le cellule nervose, private del necessario apporto di ossigeno,
subiscono un danno, che nelle successive ore si propaga alle aree cerebrali circostanti
(zona di "penombra" ischemica) (Fig.1).
La “penombra” rende ragione di circa l’80% del danno cerebrale finale; si ritiene infatti
che farmaci neuroprotettivi che siano in grado di bloccare la propagazione del danno nella
penombra possano ridurre quasi completamente sia la mortalità che le disabilità permanenti
conseguenti l’ictus. Da tempo era noto che, durante l’ictus, la scarsità di ossigeno
determinata dalla mancata irrorazione provoca il rilascio, da parte delle cellule danneggiate,
di trasmettitori infiammatori, tra cui “nucleotidi uridinici” e “cisteinil-leucotrieni”,
ma fino ad ora i ricercatori non avevano fatto chiarezza sui meccanismi con cui
queste sostanze erano in grado di contribuire al danno neurologico.
Il recettore duale identificato dallo studio é proprio il bersaglio attraverso il quale
queste molecole propagano il danno cerebrale dalla zona del core a quella della penombra.
Fasi della ricerca
Prima di questo studio, GPR17 era solo uno dei centinaia di recettori "orfani" accoppiati a
G-proteina presenti nelle banche-dati bioinformatiche, dei quali, grazie al sequenziamento
del genoma umano, é nota solo la sequenza nucleotidica , ma dei quali non si conosce né il
ligando endogeno da cui sono attivati, né la funzione nell’organismo in condizioni di salute
e malattia.
Si sapeva anche che GPR17 era “imparentato” strutturalmente e filogeneticamente con i
recettori già noti per i “nucleotidi” e “cisteinil-leucotrieni”, denominati recettori P2Y e
CysLT. Data questa stretta parentela, si sospettava che GPR17 potesse rispondere o all’una o
all’altra famiglia di trasmettitori.
La ricerca che ha portato alla "deorfanizzazione" di
GPR17 ha previsto diverse fasi ed è stata di cruciale importanza l’integrazione di competenze
diverse fra di loro complementari: la lunga esperienza del gruppo della coordinatrice (al
quale appartiene Marta Fumagalli, primo autore nello studio) nella biochimica e farmacologia
della trasmissione purinergica, le strategie di biologia molecolare di Paolo Ciana, la lunga
esperienza di Letizia Trincavelli e Claudia Verderio nei meccanismi di traduzione del
segnale, e le competenze di Luigi Sironi, Uliano Guerrini e Mauro Cimino in un modello
animale di ischemia cerebrale focale in grado di riprodurre nel roditore condizioni simili
all’ictus umano.
Innanzitutto, sulla base della sequenza nucleotidica riportata nelle banche-dati, GPR17 é
stato clonato da tessuto cerebrale ed espresso in varie linee cellulari per caratterizzarne
la farmacologia con opportuni saggi funzionali. Questi primi studi hanno permesso
innanzitutto di identificare la natura "duale" del nuovo recettore, ossia la capacità di
GPR17 di rispondere in maniera concentrazione-dipendente a due distinte famiglie di sostanze
infiammatorie, i "nucleotidi uridinici" e i "cisteinil-leucotrieni", come mostrato dalle
curve dose-risposta riportate in Figura 2A,
dove è stato utilizzato il saggio funzionale del GTPgammaS.
Con lo stesso saggio funzionale, i ricercatori hanno poi dimostrato che alcuni
farmaci già precedentemente noti agire sui recettori P2Y o sui recettori CysLT sono
grado di contrastare l'attivazione di GPR17 indotta da nucleotidi uridinici oppure da
cisteinil-leucotrieni, comportandosi quindi da “antagonisti” recettoriali (Fig. 2B-C).
I ricercatori hanno inoltre dimostrato che GPR17 é accoppiato alla proteina Gi, che
lo rende in grado di trasmettere i segnali esterni all'interno della cellula attraverso
l'inibizione dell'attività dell'adenilato ciclasi e il rilascio di calcio dai depositi
intracellulari. Lo sviluppo, da parte di Patrizia Rosa, coautrice nello studio, di un
anticorpo in grado di riconoscere specificatamente il nuovo recettore, ha permesso poi di s
tudiarne la presenza nel cervello, identificandolo sulle cellule neuronali (Fig 3).
I ricercatori hanno quindi indotto ictus cerebrale nel roditore, e, correlando
l’entita’ del danno ischemico con la presenza del recettore nella zona dell’infarto
cerebrale, hanno dimostrato che GPR17 é presente in maggior quantita’ nei neuroni che
vanno incontro a morte (Fig 4).
Infine, a riprova del ruolo determinante svolto dal nuovo
recettore nella progressione del danno ischemico, hanno dimostrato che negli animali
sottoposti ad ictus, l’inibizione di GPR17 con farmaci che bloccano il recettore
(gli stessi antagonisti impiegati nel saggio funzionale del GPTgammaS) oppure con
un un farmaco biotecnologico disegnato su misura per spegnere la proteina recettoriale,
e’ in grado di proteggere completamente gli animali dal danno ischemico (Fig 5).
GPR17 rappresenta quindi il bersaglio comune attraverso il quale nucleotidi e
cisteinil-leucotrieni inducono morte delle cellule cerebrali dopo ictus: bloccando il
recettore si blocca completamente la progressione del danno ischemico dalla zona del core
a quella della penombra.
Conclusioni
La scoperta di questo recettore rende concreta la prospettiva di sviluppare una
nuova categoria di farmaci in grado di contrastare il danno indotto dall'ischemia cerebrale.
La natura dualistica del recettore apre infatti la strada al disegno di nuovi farmaci
anti-ictus “duali”, teoricamente molto piu’ potenti dei farmaci ora disponibili, in quanto
in grado di contrastare la propagazione del danno mediata da due diverse famiglie di sostanze
infiammatorie (Fig 6).
Inoltre, il recettore può essere bloccato anche da alcuni farmaci già in uso clinico
(o preclinico), la cui struttura chimica é già nota all’azienda farmaceutica.
Uno dei farmaci che i ricercatori hanno dimostrato bloccare efficacemente GPR17 e’
gia’ in fase clinica avanzata come farmaco anti-piastrinico contro la trombosi,
una delle cause alla base dell’ictus.
L’altro e’ un farmaco già in uso clinico da molti anni per una patologica infiammatoria
cronica dell’apparato respiratorio quale l’asma bronchiale. Nonostante questi farmaci
non siano selettivi per il recettore, il conoscerne la struttura rappresenta un vantaggio
per poter avere a disposizione in breve tempo farmaci anti-ictus che agiscano potentemente
e selettivamente attraverso GPR17.
Un secondo aspetto importante é che GPR17 ha effetti protettivi anche dopo che l’ictus
e’ stato indotto, il che e' compatibile con la situazione reale in cui l'individuo
colpito da ictus deve essere trasportato in ospedale per essere sottoposto ad accertamenti
diagnostici prima di ricevere eventuali cure.
Un limite nel trattamento attuale dell’ictus
consiste proprio nel fatto che passano diverse ore fra la comparsa della malattia e
l’inizio dei trattamenti, e che nessuno dei farmaci studiati fino a questo momento è in
grado di bloccare efficacemente la progressione del danno, una volta che questo è stato
attivato.
E' inoltre interessante notare che GPR17 é presente anche nel cuore un altro organo che
va tipicamente incontro ad ischemia; la presenza di GPR17 nel cuore (oltre che nel cervello)
e le analogie esistenti fra ischemia cerebrale ed ischemia cardiaca, suggeriscono che il
nuovo recettore duale possa rappresentare un bersaglio farmacologico di interesse anche
nell’infarto miocardico, aprendo nuove prospettive nella terapia cardioprotettiva.
Il nuovo recettore da noi identificato puo’ invece essere attivato da due diversi
tipi di trasmettitori, che vengono entrambi liberati nel cervello in grande quantità
in conseguenza all’ictus. Questo nuovo recettore presenta nella sua struttura due
distinti siti di legame per queste molecole, ed e’ in grado, una volta attivato da esse,
di mediarne gli effetti deleteri di propagazione del danno nel cervello.
Grazie proprio alla sua particolare struttura, il nuovo recettore “duale” puo’
essere bloccato con due diversi tipi di antagonisti, con un effetto finale di spegnimento
della trasmissione molto piu’ potente (pannello inferiore).
Sara’ quindi possibile sviluppare farmaci anti-ictus “duali” in grado di bloccare
entrambi i siti di legame del nuovo recettore, che prevediamo essere molto piu’ potenti
dei farmaci ora disponibili.
Non a caso, i nostri esperimenti dimostrano che il knock-down (spegnimento) del recettore
con un famaco biotecnologico nel cervello di animali dopo induzione di ictus protegge
completamente dalla propagazione del danno.
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Autore: Fumagalli Marta, Verderio Claudia e Abbracchio Maria Pia
CNR Institute of Neuroscience
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