|
Articolo pubblicato il 17-06-2005
di Angela Giannattasio
Laboratorio di virologia dell'Ospedale Ascalesi di Napoli
Numero 17 - Anno 2
17 Giugno 2005
|
|
 Papillomavirus
|
GENOTIPIZZAZIONE DI HPV
Consente di tipizzare i ceppi di papillomavirus considerati ad altissimo rischio ("high risk HPV“) di induzione di carcinoma alla cervice uterina (CIN). Gli HPV high risk sono i seguenti: 16, 18, 31, 33, 35, 45, 56 e 58. La tecnologia di base è sempre la stessa (PCR-ELISA) ma in questo caso le sonde biotinilate usate sono altamente specifiche per gli otto ceppi che devono essere identificati, differendo questi per solo 7 paia di basi l’uno dall’altro.
La sensibilità del saggio è aumentata utilizzando condizioni di ibridazione altamente stringenti (temperature sufficientemente alte affinché il prodotto di PCR derivato da un certo tipo di HPV si leghi esclusivamente alla sonda biotinilata perfettamente complementare ad esso) e soluzioni di lavaggio con una concentrazione di sali tale da eliminare tutto ciò che può essersi legato al pozzetto, durante la fase di ibridazione, in modo aspecifico.
Tutti questi accorgimenti consentono di eliminare il rischio di misinterpretazione del dato (non corretta tipizzazione).
La stessa metodica può essere utilizzata per identificare i 16 ceppi di papillomavirus considerati a basso e medio rischio (“Low- Medium risk”) di induzione di carcinoma alla cervice uterina (CIN). Gli HPV low risk sono i seguenti: 6, 11, 34, 40, 42, 43 e 44. Gli HPV medium risk sono: 39, 51, 52, 53, 54, 61, 66, 69, 70, nel caso il campione in esame sia risultato negativo ai genotipi ad alto rischio oncogenico.
Un’altra tecnica utilizzata per la genotipizzazione di HPV è la Riverse Dot Blot che consente di determinare la presenza dei 25 più frequenti tipi di papillomavirus in modo semplice e veloce senza l’utilizzo di sonde radioattive. Si identificano in particolare i seguenti tipi: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 66, 69 e 70.
Questa metodica si basa sul principio della ibridazione inversa di sonde specifiche adese a strisce di nitrocellulosa con la regione virale L1 amplificata marcata con biotina. Le condizioni di ibridazione sono ad elevata stringenza tali da non permettere alcun tipo di appaiamento non perfettamente complementare. Successivamente all’ibridazione viene aggiunto un coniugato streptavidina-fosfatasi alcalina che si lega ad ogni ibrido perfettamente formato.
Segue una incubazione con i cromogeni NBT/BCIP che permette la colorazione violacea dei positivi.
SENSIBILITA’: 50 COPIE VIRALI / CAMPIONE.
Per alcune caratteristiche il test di ibridizzazione in situ è il test di scelta. È l’unico infatti, che correla la distribuzione e il tipo di virus con il tipo di cellula e quindi con il tipo di lesione. In altre parole, permette di controllare se il virus è presente nelle cellule tumorali o nel tessuto normale adiacente. Inoltre consente anche una valutazione quantitativa della sua espressione. Infine, potendo essere applicato a materiale fissato e incluso in paraffina, il test di ibridizzazione in situ permette studi retrospettivi.
In generale però la sensibilità e la specificità del test in situ sono inferiori a quella dell’ibridizzazione Blot. La sensibilità può essere migliorata usando sonde RNA cosiddette "anti-sense". La ibridizzazione in situ non consente però la valutazione dello stato fisico del virus (integrato o no).
Sierologia. Una risposta immune ad antigeni virali è stata ricercata da più autori. Il 70% delle donne con carcinoma intrauterino associato ad HPV, hanno anticorpi diretti contro un peptide codificato dalla regione genomica E2 del genotipo 16 di HPV.
Anticorpi contro i peptidi codificati da E2 ed E7 dell’HPV16 e 18 sono più comuni nelle donne con carcinoma intrauterino e carcinoma cervicale invasivo. Recentemente è stato ottenuto un anticorpo monoclonale chiamato CAMVIR-1, contro la proteina capsidica L1 dello HPV16.
Colposcopia. La colposcopia è il metodo indispensabile per la diagnosi di infezione subclinica della cervice uterina, della vagina, della vulva (vulvoscopia) e del pene (peniscopia). Oltre che per la diagnosi, questo esame è indispensabile per valutare l’estensione della lesione e per guidare la biopsia.
La colposcopia tuttavia non è in grado di distinguere, se non per pochi e insicuri parametri, tra lesioni contenenti HPV6/11 e quelle contenenti HPV16/18 o altri ad alto rischio oncogeno.
Immagine colposcopica di infezione avanzata da HPV.
SIEROLOGIA E IMMUNITÀ
I Papillomavirus umani ed animali possiedono un antigene in comune, percio’ e’ possibile solo una classificazione in genotipi e non in sierotipi. Fino ad ora si sono identificati oltre 50 genotipi diversi, di cui i piu’ frequentemente riscontrati nei carcinomi ano-genitali sono HPV16 e 18 (nel 50% dei casi), seguiti da HPV18, 31, 33 e 45 (nel 10% dei casi).
I ceppi di HPV responsabili di patologie cutanee, non sono coinvolti in patologie anogenitali; i genotipi HPV 6 e 11 sono ad alto rischio di trasmissione sessuale e si ritrovano in forma non integrata; invece HPV 16 e 18 si riscontrano in forma episomiale nelle lesioni precoci o in carcinomi in situ ed in forma integrata nei tumori primari. Pertanto, non essendo quasi mai in fase di replica virale attiva, il rischio di trasmissione sessuale è ridotto. In vitro tutti i genotipi sono in forma integrata nelle cellule. L’infezione con HPV è comune in uomini omo/bisessuali e risulta strettamente correlata con immunodepressione e, ovviamente, con il numero di rapporti sessuali non protetti con partner diversi.
È stato condotto uno studio su 93 pazienti HIV+ e 20 HIV- ed è risultato che l’infezione da HPV e’ strettamente correlata al progressivo diminuire dei linfociti CD4+. L’infezione dura oltre 6 mesi nel 61% dei pazienti HIV+ e nel 95% dei pazienti con AIDS conclamato. In oltre il 50% di queste infezioni si è riscontrato il genotipo HPV16 e 18.
EPIDEMIOLOGIA
Negli Stati Uniti l’infezione da Papilloma è la piu’ diffusa tra tutte la malattie a trasmissione sessuale. È una malattia estremamente contagiosa e approssimativamente 2/3 di tutti gli individui che hanno rapporti sessuali con un partner infetto, svilupperanno HPV entro 3 mesi.
Nel 1990 i centri per il controllo delle malattie hanno stimato che negli USA sono stati diagnosticati 800.000 nuovi casi di infezioni da HPV. Di questi, una percentuale significativa progredisce da infezione latente da HPV-correlata, a manifestazioni cliniche di cancro alla cervice.
Donne con evidenze citologiche di HPV hanno avuto un incremento 16 volte maggiore nel rischio di progressione verso carcinoma, rispetto a donne non infette. La rivista Who ha riportato che il cancro alla cervice ha un’incidenza di 500.000 nuovi casi nel mondo ogni anno, di cui il 45% progredisce sino alla morte. Di questi ultimi, almeno il 90% contiene DNA dell’HPV; al contrario, uomini con tumori intraepiteliali al pene raramente evolvono a cancro invasivo e mostrano HPV allo stato latente.
Ci sono più di 70 tipi di HPV, 40 dei quali infettano la zona urogenitale: l’HPV16 è il tipo più comune ed è responsabile del 50% dei casi di cancro alla cervice, seguito dai tipi 18, 45, 31 e 33. Nei neonati i tipi di HPV più diffusi sembrano essere il 16 e il 18 e persistono soltanto per un breve periodo di tempo, mentre nei bambini il tipo 6 e il tipo 11 sono quelli prevalenti.
La diffusione dell’HPV risulta essere diversa, a seconda del metodo utilizzato per individuarne la presenza; la mancanza di un metodo standard di ricerca fa sì che gli studi di tipo epidemiologico siano molto difficili e trovino range di diffusione ampiamente variabile. Servendosi della citologia come strumento per la scoperta dell’HPV, si è visto che il 3-11% di tutte le donne ha un’infezione da HPV connessa con malattie urogenitali.
L’indice di diffusione, quando viene usata la colposcopia, sale invece al 33%, mentre i test più sensibili, come gli studi mediante ibridazione, hanno indicato che il range di diffusione dell’HPV tra gli individui di sesso femminile è attorno al 3-38%; inoltre nuovi metodi di PCR hanno evidenziato una diffusione tra il 20 e il 46%. La citologia e la colposcopia sono entrambi test istologici e sono importanti nella ricerca di infezioni da HPV con manifestazioni cliniche. Tuttavia un limite è che questi test non possono identificare un’infezione latente o il tipo di HPV che infetta il paziente.
Nonostante la mancanza di adeguate tecniche standard di identificazione per quantificare la diffusione e l’incidenza di HPV, alcune tendenze sono comunque emerse. Donne giovani e attive sessualmente hanno più alta incidenza di HPV, mentre donne più anziane e monogame hanno un’incidenza più bassa. La diffusione dell’HPV raggiunge i massimi valori tra i 15 e i 25 anni e decresce bruscamente con l’avanzare dell’età. Nessuna valutazione conclusiva si è potuta trovare per l’HPV negli uomini a causa delle moltissime esperienze di infezioni latenti e della rarita’ di sintomi visibili della malattia.
Alcuni possibili fattori di rischio sono stati identificati in associazione all’incremento di infezioni da HPV:
- rapporti sessuali con molti partners
- una infezione da Herpesvirus
- il fumo di sigaretta
- uso di contraccettivi orali
- stato di gravidanza.
Prevalence of hpv in cervical cancer: a worldwide perspective
Considerazioni iniziali Studi epidemiologici hanno mostrato che l’associazione dell’HPV con il cancro alla cervice e’ notevole, indipendentemente da altri fattori di rischio, e consistente in vari paesi. Ci sono piu’ di 20 tipi diversi di HPV associati al cancro, ma si conosce ancora poco circa la loro distribuzione geografica.
Scopo L’intento e’ di determinare se l’associazione tra HPV e cancro alla cervice sia consistente a livello mondiale e analizzare le variazioni geografiche nella distribuzione dei tipi di HPV.
Metodi Piu’ di mille campioni presi da pazienti con cancro invasivo alla cervice, sono stati raccolti e conservati mediante tecniche di congelamento presso 32 ospedali di 22 Paesi. I preparati istologici di tutte le pazienti sono stati sottoposti a controlli, per confermare la diagnosi e accertarne le caratteristiche.
Sono state usate analisi basate sulla PCR con le quali si sono potuti scoprire piu’ di 25 tipi di HPV. Un modello di Poisson e’ stato applicato ai dati del tipo virale in relazione alla regione di sviluppo, per valutarne l’eterogeneita’ geografica.
Risultati L’HPV e’ stato individuato nel 93% dei tumori, senza significative variazioni nella positivita’ nei diversi Paesi. HPV16 era presente nel 50% dei campioni, HPV18 nel 14%, HPV45 nell’ 8% e HPV31 nel 5%. Inoltre l’HPV16 risultava il tipo predominante in tutti i paesi, eccetto l’Indonesia, dove l’HPV18 era piu’ comune.
C’erano significative differenze geografiche, invece, per la diffusione di alcuni tipi virali meno comuni. Infatti un cluster di HPV45 era visibile in Africa Occidentale, mentre HPV39 e 59 erano quasi interamente limitati, per aree di diffusione, all’America Centrale e Meridionale. Nei tumori a cellule squamose, predomina l’HPV16 (51% dei campioni), mentre HPV18 predomina negli adenocarcinomi (56%).
Conclusioni I risultati confermano il ruolo di vari tipi di HPV, che sono trasmessi sessualmente come principale fattore eziologico del cancro alla cervice a livello mondiale. Questi studi hanno anche suggerito che piu’ tipi di HPV genitali sono associati con la neoplasia, almeno occasionalmente.
Implicazioni La dimostrazione che piu’ di 20 differenti tipi di HPV siano associati con cancro alla cervice, ha importanti implicazioni nella strategia di prevenzione di tale tumore, che include lo sviluppo di vaccini per l’HPV.
PREVENZIONE
VACCINI
Le conseguenze di un’infezione da HPV, minacciano potenzialmente la vita di molte donne e danno origine quindi ad un’urgente necessità di un vaccino, per prevenire le malattie provocate dal virus. Ci sono più di 70 differenti genotipi di HPV umani e l’immunità conferita da un vaccino tipo-specifico, probabilmente non è utile contro gli altri tipi.
È necessario quindi un vaccino polivalente che includa tutti i tipi, ma un tale vaccino è sicuramente molto costoso. Attualmente non è disponibile un vaccino per l’HPV, anche perchè non si è in grado di far crescere virus infettanti in colture di tipo tissutale, poichè la loro replicazione è legata allo stato di differenziazione delle cellule epiteliali.
Sono state elaborate due diverse strategie di immunizzazione:
Creazione di un vaccino profilattico prevede l’uso di proteine virali ricombinanti del capside, come elementi costituenti di un vaccino a scopo profilattico. Questa strategia si basa sulla sperimentazione di vaccini efficaci contro i papillomavirus animali. Per esempio le cavie possono essere immunizzate contro BPV, usando estratti di condilomi che quest’ultimo provoca.
Il siero delle cavie immunizzate mostra la presenza di anticorpi, diretti contro specifici epitopi conformazionali sulla superficie dei virioni. Questi epitopi sembrano essere la chiave per indurre una risposta anticorpale di tipo protettivo contro gli HPV.
Le proteine del capside virale L1 e L2, quando vengono isolate, autoassemblano in capsidi che sono identici ai virioni HPV presenti in natura e posseggono quindi gli stessi epitopi conformazionali dei virioni nativi: questa proprieta’ le rende potenziali immunogeni ideali. Ricombinanti che esprimono L1 e L2 sono in grado di stimolare infatti l’immunita’ nei confronti dell’infezione virale. Per esempio nel caso del CRPV (cottontail rabbit papilloma virus) l’immunizzazione con un plasmide codificante L1 consente la produzione di anticorpi specifici che danno immunita’ contro questo virus.
Risultati simili si sono ottenuti con il BPV e questi studi hanno anche confermato l’importanza degli epitopi conformazionali nell’indurre l’immunità. Il modo migliore per introdurre L1 e L2 nell’ospite non è ancora stato identificato, dal momento che diversi ricercatori usano metodi diversi, inclusi lieviti, virus bovini e il baculovirus come vettori.
I vantaggi di questa strategia sono che:
L1 e L2 sono sufficientemente antigeniche
consentono l’immunizzazione in modelli animali
non contengono DNA virale, che potrebbe essere potenzialmente cancerogeno per l’ospite
mostrano una certa quantita’ di sequenze conservate (specifiche per ogni tipo)
contengono proteine virali del capside di diverse razze, che permetterebbero di ottenere il vaccino multivalente, necessario per proteggere contro i numerosi tipi di HPV oncogenici
L’immunita’ sistemica sembra essere sufficiente per la protezione, piu’ di quanto non lo sia l’immunita’ mucosale; tuttavia i modelli di studio animali non ne dimostrano l’efficacia sul tratto genitale, nè la durata dell’immunizzazione. La prossima tappa consisterà nel provare questi capsidi autoassemblati virali in un vaccino profilattico.
Creazione di un vaccino terapeutico una strategia simile è stata utilizzata per prevenire lo sviluppo di tumori in individui infettati dall’HPV. Questi potenziali vaccini si basano sulle oncoproteine del virus E6 ed E7. Molti esperimenti su animali hanno mostrato l’efficacia protettiva di queste proteine nella prevenzione della formazione di tumori.
Quando dei topi sono stati immunizzati con fibroblasti che esprimevano le proteine E6 ed E7 dell’ HPV16, hanno mostrato di respingere l’attacco da parte di una linea cellulare che, a sua volta, presentava gli oncogeni dell’HPV. Anche virus ricombinanti di bovino, che esprimevano le BPV E6 ed E7, sono stati utilizzati nel bloccare lo sviluppo del tumore, quando le cavie venivano infettate con cellule BPV.
Sono stati testati molti differenti carriers per i peptidi E6 ed E7, incluse cellule dendritiche di milza, ISCAR (una proteina carrier dell’E. Coli) e l’HbcAg (core dell’antigene dell’epatite B). In ogni caso vengono evidenziati anticorpi IgG e IgG2a insieme a IL2 e IL4 e in vivo l’immunita’ nei confronti di cellule tumorali transfettate con E6 ed E7. Ciascuna di queste ultime metodologie, ha permesso di mettere a punto i primi esperimenti clinici per verificare l’efficacia di virus ricombinanti viventi, che esprimano le proteine E6 ed E7 degli HPV16 e 18. Per ognuno degli 8 pazienti testati sono state riscontrate risposte ai virus bovini, con formazione di anticorpi specifici per l’HPV; inoltre in un paziente c’è stato anche un incremento nella risposta di tipo CTL nei confronti del virus.
Poichè non sono stati riscontrati effetti collaterali, questo studio apre le porte per ulteriori indagini sul potenziale uso di questo vaccino per l’immunoterapia. Solitamente, infatti, la stimolazione di una risposta immunitaria contro E6 ed E7 sembra dare risultati positivi come metodo per indurre una regressione o bloccare questi tumori.
Stimolazione di CTL mediante un promotore di oncoproteine
Un altro metodo per stimolare la risposta immunitaria contro l’HPV, in grado di indurre lo sviluppo di tumori, è quello di stimolare i CTL mediante un promotore di oncoproteine. Questa tecnica consiste nella stimolazione in vitro dei linfociti del sangue periferico con peptidi E6 ed E7 e citochine e nella loro successiva reintroduzione nell’organismo del paziente come terapia. Oggi la MedImmune (un’associazione biotecnologica) sta sviluppando vaccini per diversi tipi di HPV associati a condilomi genitali e cancro alla cervice uterina. Il primo di questi vaccini, Medi 501, è costituito dalla proteina del capside dell’HPV11 che in vitro si autoassembla in particelle simil-virali (VLPs). Le VLPs, prodotte in vitro con la tecnologia del DNA ricombinante, imitano la struttura del papillomavirus in vivo ma non danno infezione. Gli scienziati hanno dimostrato l’efficacia di un vaccino VLP usando un modello di infezione da HPV nei cani. Questo modello utilizza un virus detto papillomavirus orale canino (COPV) che dà infezioni molto simili all’HPV, dal momento che provoca sia condilomi che tumori a livello della mucosa. Nel dicembre del 1995 MedImmune e i suoi collaboratori hanno pubblicato i risultati degli studi, che indicano che un vaccino è in grado di proteggere i cani contro i condilomi derivanti dall’infezione con il virus. Il Medi 501 è attualmente nella fase I di sperimentazione clinica, atta a valutarne la sicurezza, la tolleranza e l’immunogenicità, e si è in attesa che inizi la fase I degli studi con Medi 504 e Medi 503 (vaccini per gli HPV18 e 16) per creare vaccini multivalenti da sperimentare in fase III e IV.
PROFILASSI
Poichè l’infezione viene solitamente contratta da uomini e donne giovani, i rapporti sessuali occasionali devono essere protetti. Persone clinicamente guarite dall’infezione da HPV potrebbero essere dei portatori e nascondere un’infezione latente, costituendo quindi un serio pericolo per i partners presenti e futuri.
|
Autore:Angela Giannattasio
Scarica questo articolo nel tuo computer
 
© 2005 Scienzaonline.com
|
|
|
