|
Articolo pubblicato il 17-06-2005
di Angela Giannattasio
Laboratorio di virologia dell'Ospedale Ascalesi di Napoli
Numero 17 - Anno 2
17 Giugno 2005
|
|
 Papillomavirus
|
Sedi dell’infezione da HPV
| Vulva |
Vagina |
cervice uterina |
| Ano |
Perineo |
area perianale |
| Uretra |
Vescica |
uretere |
| Pene |
Scroto |
cute |
| Labbra |
Cavità orale |
lingua |
| Laringe |
Trachea |
bronchi |
| cavità nasali |
Esofago |
congiuntiva |
L’infezione da HPV del tratto genitale inferiore viene divisa in: clinica, subclinica e latente.
Infezione clinica. La diagnosi delle forme cliniche di infezione da HPV non presenta difficoltà (vedi figura). L’aspetto macroscopico dei Condilomi esofitici (Condilomi acuminati) è il seguente:
L’infezione clinica è rara in sede cervicale; è una forma visibile ad occhio nudo consistente in una proliferazione ipercheratosica, filiforme, biancastra, meglio evidenziata in colposcopia come una lesione priva di vascolarizzazione e con test Schiller iodochiaro.
Un secondo aspetto visibile ad occhio nudo è quello cheratosiforme; un terzo aspetto infine è quello della Papillomatosi.
Infezione subclinica. L’identificazione di condilomi non acuminati (condilomi piatti, infezione subclinica da HPV) è di recente insorgenza. Essa è la più frequente forma di infezione da HPV della cervice.
La diagnosi dell’infezione subclinica, a livello sia della cervice uterina che di vulva, vagina e pene, è difficile. Essa è possibile solo mediante l’uso del colposcopio, dopo applicazione di soluzione acquosa di acido acetico al 5%.
A livello istologico, l’infezione clinica e subclinica presentano iperplasia dello strato basale, acantosi ed alterazioni citopatiche caratteristiche, quali la presenza di alone coilocitico, picnosi o ingrandimento ed omogeneizzazione della cromatina nucleare, bi-pluri-nucleazione, discrepanza di maturazione nucleocitoplasmatica con formazione di piccole cellule a citoplasma maturo cheratinizzato e con nucleo picnotico, definite discheratociti.
Quadro citologico della infezione da HPV
Vengono distinte diverse tipologie di infezione da HPV (nonostante le alterazioni epiteliali siano sovrapponibili): condiloma piatto, invertito, appuntito, acuminato. L’infezione da HPV del tratto genitale inferiore può essere associata a neoplasia intraepiteliale; in tal caso si possono riscontrare istologicamente diverse situazioni.
Infezione latente. Dopo il contagio il virus può scomparire, vinto dalle difese dell’organismo, o rimanere latente anche per lunghi periodi di tempo (è stata dimostrata la presenza di particelle virali nelle aree cutanee circostanti la lesione primaria trattata). La latenza dell’HPV è un aspetto cruciale per la biologia di questo virus.
La permanenza del virus allo stato latente spiega le recidive e spiega anche la fluttuazione nel tempo della presenza di HPV DNA nei tessuti. Di certo la latenza del virus è responsabile della ricomparsa dopo trattamento e questa latenza rende impossibile una diagnosi differenziale tra persistenza e reinfezione.
L’infezione latente può essere attivata in donne immunodepresse, così come durante trattamenti immunosoppressivi per malattie neoplastiche o per autoimmuni. Il contagio è quindi mantenuto dalla forma latente.
I dati ambulatoriali relativi all’infezione da HPV riguardano la forma clinica. La prevalenza degli effetti citopatici da HPV negli screening citologici, è compresa tra lo 0.5% e il 4.1%, mentre su pazienti viste in corsia ginecologica raggiunge il valore del 16%.
Immagine colposcopica dell’infezione da HPV
METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DELL’INFEZIONE DA HPV
Citologia. Tre sono gli aspetti più caratteristici dell’HPV:
alone coilocitico
presenza di discheratociti
bi-multinucleazione.
I coilociti sono cellule profondamente lese dal virus, ma sono cellule vive ed infettanti; il loro sfaldamento dalla sede dell’infezione primaria e il successivo contatto con altre zone del tratto genitale, viene a realizzare un "trasporto metastatico" dell’infezione.
Oggi è documentato che la coilocitosi è patognomonica dell’infezione da HPV.
Microscopia elettronica. All’immagine ultramicroscopica, i nuclei possono essere ingranditi e presentare aspetto chiaro con cromatina prevalentemente marginata, o essere piccoli e rotondi con cromatina compatta e ipercromatica. Le particelle virali sono intranucleari. Esse hanno forma rotonda e dimensione regolare.
Il loro diametro medio è di 400 Å. Va ricordato che non si osservano particelle virali negli strati spinoso e basale. Particelle virali intranucleari si riscontrano nei nuclei delle cellule coilocitotiche, nel 50% circa dei casi di infezione subclinica, così come di infezione clinica.
Immunoistochimica. Attraverso la tecnica ABC (avidina-biotina) ed usando un antisiero, preparato attraverso immunizzazione con virioni distrutti da una verruca plantare, è possibile mettere in evidenza un antigene interno capsdico comune in lesioni mature, che consentono cioè la produzione di proteine strutturali capsidiche del virus.
N.B. Sia la microscopia elettronica che l’immunoistochimica, mettendo in evidenza solo quanto viene codificato dall’espressione tardiva del gene dell’HPV e che si verifica solo in cellule mature, non sono in grado di consentire lo studio di lesioni caratterizzate da difetti di maturazione, quali le neoplasie intraepiteliali di grado elevato.
Inoltre, è degno di nota il fatto che l’immunoistochimica può essere positiva in casi in cui la microscopia elettronica è negativa e viceversa. Va sottolineato inoltre che entrambe le metodiche, mettendo in evidenza rispettivamente l’assemblaggio completo del virus e la sintesi di proteine capsidiche che non diversificano nei vari tipi di papilloma virus, non sono in grado di fornire indicazioni sul tipo virale.
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
PCR ed eventuale genotipizzazione di HPV
ibridizzazione in situ.
La Polymerase chain reaction (PCR) è una tecnica di sintesi e amplificazione enzimatica in vitro di sequenze specifiche note di DNA virale. La PCR permette di rivelare quantità minime di genomi virali e geni, rappresentati in singola copia, anche nei casi in cui il DNA bersaglio è di quantità o qualità insufficiente per essere analizzato con successo con le metodiche standard.
Inoltre essa può essere utilizzata, oltre che su DNA purificato, su lisati cellulari o sezioni di tessuto fissato incluso in paraffina, permettendo così analisi e studi retrospettivi.
ESTRAZIONE DEL DNA DI HPV DA SOSPENSIONI CELLULARI E/O DA MATERIALE BIOPTICO:
I sistemi di estrazione degli acidi nucleici (RNA e DNA) dai campioni biologici svolgono la funzione di rendere disponibili il DNA o l’RNA virale e di eliminare o inattivare eventuali inibitori in modo da aumentare l’efficienza delle successive reazioni enzimatiche. Nel caso della PCR ciò corrisponde ad un consistente incremento della sensibilità della metodica e della ripetitività dei risultati.
Il DNA di HPV può essere estratto partendo:
- da sospensioni cellulari (prelievi con spatola di Ayre, Cytobrush, Bactopick)
- materiale bioptico (incluso in paraffina, fresco e/o congelato)
La procedura prevede la lisi delle cellule mediante un trattamento termico in soluzione alcalina, l’eliminazione di inibitori con una resina chelante, la neutralizzazione dell’eccesso di alcali con un tampone.
AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE DI HPV:
Ci sono vari metodi per amplificare il DNA di HPV. In questa sede illustreremo i principali metodi in uso.
- La procedura prevede l’esecuzione di una reazione di amplificazione specifica, per la regione genomica L1 che evidenzia gli HPV genitali appartenenti ai genotipi di rilevanza clinica (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 66, 68). La sensibilità della reazione permette di rilevare la presenza nella provetta monotest di almeno 50 genomi virali(~ 0,5 fg).
Il prodotto di amplificazione (~450 bp) può essere rivelato mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2-4%. Il marker di peso molecolare usato è Hinf I, mentre il gene house-keeping utilizzato per verificare la bontà dell’amplificazione è la ß globina.
- Il sistema è basato sulla estrazione del DNA/RNA da fluidi biologici, tessuti freschi, congelati e paraffinati a cui segue l’amplificazione della regione conservata L1 con primers MY09-MY11 digossigenati, in grado di amplificare la maggior parte degli HPV più importanti dal punto di vista clinico (prodotto di PCR di circa 450 bp).
Segue l’ibridazione del prodotto di PCR ottenuto a una sonda universale specifica che è complementare alla parte interna del prodotto stesso. La sonda specifica è marcata con biotina che si lega covalentemente alla streptavidina coattata sulla superficie di un pozzetto di una micropiastra in modo da permettere l’immobilizzazione dell’ibrido prodotto di PCR/sonda specifica.
I prodotti di amplificazione aspecifici non si ibridizzeranno alla sonda e verranno rimossi durante i lavaggi stringenti successivi.
L’ibrido legato alla micropiastra in modo specifico è rivelato da un anticorpo anti-digossigenina coniugato alla perossidasi, attraverso l’uso di un substrato colorimetrico.
L’assorbanza viene letta in un ELISA reader a 405 nm ( filtro di riferimento 492 nm). La sensibilità del sistema è di 30–50 genomi/campione.
L'articolo prosegue nella prossima pagina
|
Autore:Angela Giannattasio
Scarica questo articolo nel tuo computer
 
© 2005 Scienzaonline.com
|
|
|
