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Articolo pubblicato il 17-11-2005
di Serena Fabbrini e Aldo Ceriotti
dell'Istituto di Biologia e Biotecnologia agraria del CNR di Milano
Numero 22 - Anno 2
17 Novembre 2005
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 Tossine vegetali alleate nella lotta contro i tumori
Le tossine vegetali
Oltre ad essere una fondamentale fonte di alimenti, ossigeno e di diversi materiali, le piante ci offrono da millenni sostanze terapeutiche come il taxolo o la morfina. In parecchie piante sono inoltre espresse, nei semi o nelle foglie, proteine tossiche con attività inattivatrice dei ribosomi. Le cosidette RIP (ribosome-inactivating protein) sono delle N-glicosidasi che agiscono depurinando l'RNA ribosomiale delle cellule eucariotiche bloccandone la sintesi proteica e provocando così la morte cellulare (figura 1).
Figura 1
La più nota tra queste tossine e' ricina, una proteina costituita da una subunita' A cataliticamente attiva ("Active") e da una subunita' B ("Binding") che le consente di legarsi a residui di galattosio presenti sulla superficie delle cellule, agendo come una vera e propria chiave che consente a ricina di entrare virtualmente in tutte le cellule di mammifero (figura 2). Questa proprietà rende ricina estremamente citotossica, tanto che pare sia stata usata come arma ai tempi della guerra fredda. All'inizio degli anni settanta, grande scalpore aveva destato la morte di un dissidente bulgaro a Londra che era stato semplicemente ferito con la punta di un ombrello "alla ricina".
Figura 2 - Le RIP possono essere di tipo I o di tipo II
Le due tossine vegetali mostrano diverse IC50 (Concentrazione che inibisce il 50 % della sintesi proteica in cellule), mentre la tossicità di SAP e’ nell’ordine micromolare, ricina e’ milioni di volte più tossica: IC50 0.3-4 pM!!
Le RIP possono essere di tipo II come la ricina o di tipo I come la saporina (SAP, figura 2) espressa nei semi di Saponaria officinalis, una pianta che cresce selvatica da noi lungo i fossi e che appartiene alla famiglia dei garofani.
Le RIP di tipo I non hanno una "chiave" efficiente per entrare nelle cellule di mammifero e sono quindi di per se molto poco citotossiche. Possono però essere unite ad una seconda proteina che funzioni da "chiave" ed essere così rese molto tossiche verso quelle cellule che espongono in superficie la giusta "serratura".
La ricerca biomedica
Mimando il ruolo di "chiave" della catena B di ricina, si possono ottenere tossine chimeriche, in cui la proteina tossica è accoppiata o ad un anticorpo monoclonale (come nelle "Immunotossine", figura 3) oppure a un dominio di legame capace di associarsi a specifici recettori (come nelle Ligando-tossine ricombinanti, figura 3). Fornendo alla tossina la giusta "chiave", la tossina chimerica risultante può essere utilizzata per uccidere selettivamente cellule tumorali.
Figura 3
Le tossine chimeriche possono agire anche a concentrazioni molto basse (<100 microgrammi/kg)
ONTAK e' la prima chimera, basata su una tossina difterica modificata fusa ad InterLeukina-2 (1) ad essere stata approvata nel 1999 negli USA, dalla Food and Drugs Administration, per l'utilizzo su pazienti con linfomi che esprimono recettori per IL-2.
Con queste strategie di veicolazione possiamo indirizzare selettivamente anche le RIP vegetali contro una popolazione di cellule bersaglio ben caratterizzata. Catena A di ricina e saporina sono già state utilizzate in precedenza per ottenere diverse chimere, fra cui quelle elencate in tabella 1 & 2.
Tabella 1
Immunotossine basate su catena A di ricina
| Immunotossina |
Specificità di recettore |
Obiettivi potenziali |
| MDX-44 |
CD64 |
Leucemia mieloide acuta |
| BW704dgA |
GD2 |
Neuroblastoma |
| CD22-rec ricin A |
CD22 |
Linfomi B |
| RFT5-dgA |
CD25 |
Linfoma di Hodgkin |
| HD37-gdA |
CD19 |
Linfomi non-Hodgkin |
| DA7 |
CD7 |
Leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) |
Tabella 2
Tossine chimeriche basate su Saporina
| Tossina chimerica |
Specificità di recettore |
Obiettivi potenziali |
| Anti-B7-1 |
B7-1 |
Linfoma di Hodgkin |
| BU12-SAP |
CD19 |
Linfoma dei linfociti B |
| HB2-SAP |
CD7 |
Leucemia linfocitica acuta |
| ATF-SAP* |
Recettore dell'urochinasi |
Tumore del seno, melanoma, carcinoma del colon e dell'ovaio |
| bFGF-SAP* |
Recettore del fattore di crescita dei fibroblasti |
Carcinoma prostatico, melanoma, teratocarcinoma dell'ovaio. |
HBEGF-L22-SAP*
*Proteina di fusione |
Recettore per EGF umano (fattore di crescita epidermico). |
Numerosi tra cui carcinomi mammari |
Due "step" cruciali per il successo e l'efficacia di queste strategie sono (a) l'entrata efficiente della chimera nella cellula bersaglio, tramite endocitosi mediata da recettore e (b) la capacità della tossina di raggiungere il comparto citosolico dove si trovano i ribosomi (figura 4A). Alcuni meccanismi cellulari coinvolti in questi due passaggi chiave sono stati chiariti. Il percorso di internalizzazione di una delle chimere cha abbiamo prodotto è stato caratterizzato (2,3) (figura 4B). Inoltre, insieme a colleghi inglesi abbiamo dimostrato che il percorso intracellulare compiuto da saporina (e da una sua chimera) per entrare nel citosol in cellule intossicate e' diverso da quello seguito dalla catena A di ricina (4). Infatti, saporina, dopo essere entrata nella cellula non passa per il complesso di Golgi (figura 4). Questi studi ci aiuteranno a potenziare la capacità di dislocazione al citosol delle chimere basate sulla saporina.
Figura 4A
Recombinant Immunotoxin Collaborative Research Group (RICG).
Siamo giunti, infine, ad un altro percorso che ha portato due giovanissimi studenti dello Hampshire, Alex Tong e Ben Matlock ad attraversare l'Inghilterra in bicicletta per arrivare fino a Roma. I due giovani sono partiti da Southampton per raccogliere fondi a sostegno della nuova iniziativa di Leukaemia Busters che ha come missione lo sviluppo di molecole per la cura delle leucemie. La charity inglese (www.leukaemiabusters.org.uk) si occupa da anni di sostenere il lavoro del gruppo di David Flavell, Patologo al Southampton General Hospital. Alcuni anni fa Flavell ha mostrato come un coktail di tre immunotossine, in cui saporina è coniugata a tre diverse "chiavi", ognuna capace di riconoscere uno specifico marcatori tumorale (la "serratura"), presente sui linfomi di tipo B, e' curativo in un modello di topo per questa malattia (5). Il Prof. Flavell aveva già iniziato alcune sperimentazioni cliniche di fase I su pazienti. David e sua moglie Bee hanno profuso inesauribili energie in queste ricerche, una forza d'animo che proviene dal profondo del loro cuore. Tredici anni fa hanno perso il loro primogenito Simon all'età di 12 anni e da allora sono alla ricerca di una cura mirata per quei malati leucemici, come Simon, che non possono beneficiare delle cure chemioterapiche o di un trapianto di midollo compatibile.
Logo della leukaemia busters
Ci siamo incontrati qualche anno fa, accomunati dal fatto di perseguire la stessa strategia e dall'uso della stessa tossina: il nostro gruppo in Italia aveva sfruttato tecniche di DNA ricombinante per ottenere una tossina di fusione con saporina contro cellule ad elevato potenziale anti-metastatico (2). L'incontro si e' rivelato decisivo.
Figura 4B - La Chimera entra in una cellula bersaglio
L'associazione inglese ha, infatti, deciso quest'anno di finanziare un network italiano di laboratori di ricerca per sviluppare nuove versioni ricombinanti di una serie di chimere che sono state prodotte presso i laboratori di Southampton. A quest'iniziativa partecipano il Consiglio Nazionale delle Ricerche e le Università di Verona, Siena e L'Aquila. I ricercatori cercheranno di ottenere delle versioni delle immunotossine completamente ricombinanti. Rodolfo Ippoliti (L'Aquila) produrrà e fornirà al gruppo di Alessandro Pini (Siena) gli antigeni necessari per la selezione di anticorpi ricombinanti. Questi ultimi, rispetto a quelli precedentemente utilizzati, saranno di dimensioni minori e di tipo "umanizzato". Aldo Ceriotti e Serena Fabbrini svilupperanno, presso i laboratori di Milano del Consiglio Nazionale delle Ricerche, un sistema innovativo per la produzione delle fusioni ricombinanti. Marco Colombatti (Verona) e David Flavell (Southampton) effettueranno i test pre-clinici necessari per verificare l'efficacia e la specificità delle immunotossine ricombinanti su cellule leucemiche e nei modelli animali.
La decisione da parte di Leukaemia Busters di affidare questo lavoro ad un network italiano rappresenta un importante riconoscimento delle competenze finora accumulate dai diversi gruppi di ricerca che sono coinvolti in questo ambizioso progetto.
Carta d'identità Saponaria officinalis
Saporina costituisce il 7% delle proteine del seme di Saponaria officinalis
è una N-glicosidasi in grado di inibire la sintesi proteica.
Proprietà
inattiva i ribosomi uccidendo le cellule animali
Insieme a David Flavell coroneremo un bellissimo sogno, quello di svolgere della ricerca biomedica con un'alta probabilità di ricaduta per i pazienti. La sinergia tra l'expertise italiana sul fronte ricombinante e la loro esperienza pre-clinica e medica dara' sicuramente i suoi buoni frutti. Ci auguriamo di far conoscere Leukaemia Busters anche in Italia e di riuscire a farla sostenere.
Fotografia di Gruppo - Verona
Le persone nella foto sono i partecipanti all'incontro di preparazione del RICG a Verona, l'anno scorso, e sono partendo da destra: Drssa Roberta Traini, dottoranda a Verona, Dr. Aldo Ceriotti, CNR, Milano (in piedi), Drssa Serena Fabbrini CNR, Milano, Prof. Alessandro Pini Università di Siena (in piedi), Bee Flavell, David Flavell (in piedi), Prof. Rodolfo Ippoliti Universita' dell'Aquila e le due fanciulle in primo piano: Drssa Teresa Lopardo, tirocinante a Milano (inginocchiata), Drssa Valeria Giordani, dottoranda a L'Aquila ed infine in secondo piano il Prof. Marco Colombatti dell'Universita' di Verona che ci ha gentilmente ospitati per quell'occasione e che ci ospiterà nuovamente il prossimo Dicembre per lo "Start-up meeeting" del progetto RICG. Il Prof. Colombatti ha messo sul sito una breve presentazione del progetto RICG coordinato dal Prof. Flavell e finanziato dalla Leukaemia busters.
Referenze:
- C.F. LeMaistre, M.N. Saleh, T.M. Kuzel, F. Foss, L.C. Platanias, G. Schwartz, M. Ratain, A. Rook, C.O. Freytes, F. Craig, J. Reuben & J.C. Nichols. Phase I trial of a ligand fusion-protein 779(DAB389IL-2) in lymphomas expressing the receptor for Interleukin-2, Blood (1998) 91, 399-405.
- M.S. Fabbrini, D. Carpani, I. Bello & M. R. Soria. The Amino-terminal fragment of human urokinase directs a recombinant chimeric toxin to target cells: internalization is toxin mediated. FASEB J (1997), 11, 1169-1176
- R. Ippoliti, E. Lendaro, P.A. Benedetti, M.R. Torrisi, F. Belleudi, D. Carpani, M.R. Soria & M.S. Fabbrini. Endocytosis of a chimera between human prourokinase and the plant toxin saporin: an unusual internalization mechanism. FASEB J (2000) 14, 1335-1444.
- R. Vago, C. J. Marsden, J. M. Lord, R. Ippoliti, D. J. Flavell, S-U. Flavell, A. Ceriotti & M. S. Fabbrini. Saporin and ricin A chain follow different intracellular routes to enter the cytosol of intoxicated cells. FEBS J (2005) 272, 4983-4995
- D.J. Flavell, K.A. Noss, Pulford, N. Ling, S-U Flavell. Systemic therapy with 3BIT, a triple combination cocktail of anti-CD19, -CD22, and -CD38-saporin immunotoxins, is curative of human B-cell lymphoma in severe combined immunodeficient mice. Cancer Res. (1997) 57, 4824-4829.
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Autore: di Serena Fabbrini e Aldo Ceriotti
dell'Istituto di Biologia e Biotecnologia agraria del CNR di Milano
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